معرفی میکروسکوپ فلورسانس

•  میکروسکوپ فلورسانس

جذب نور و متعاقب آن تابش مجدد نور توسط نمونه های آلی و معدنی معمولاً نتیجه پدیده های فیزیکی تثبیت شده ای است که به عنوان فلورسانس یا فسفرسانس  توصیف می شوند.
انتشار نور از طریق فرآیند فلورسانس تقریباً همزمان با جذب نور تحریکی یا اولیه است. بعد از قطع نور اولیه، بازتاب آن قطع می شود. هنگامی که انتشار پس از خاموش شدن نور اولیه برای مدت بیشتری ادامه یابد، این پدیده به عنوان فسفرسانس شناخته می شود.

دانشمند بریتانیایی Sir George G. Stokes برای اولین بار فلورسانس را در سال 1852 توصیف کرد و مسئول ابداع این اصطلاح بود، او دریافت که فلوریت معدنی یا فلوراید کلسیم نور قرمز را هنگامی که توسط نور ماوراء بنفش تحریک می شود، منتشر می کند. وی اشاره کرد که انتشار فلورسانس همیشه در طول موج طولانی تر از نور اولیه رخ می دهد. تحقیقات در قرن نوزدهم نشان داد که بسیاری از نمونه ها (از جمله مواد معدنی، کریستال ها، رزین ها) هنگامی که با نور ماوراء بنفش مورد تابش قرار می گیرند، فلورسنت می شوند.

فلوروفور (با نام فلوروکروم یا کروموفور نیز شناخته می شود) یک ترکیب شیمیایی فلورسنت است که می تواند با دریافت نور، نور را دوباره ساطع کند. فلوروفورها معمولاً شامل چندین گروه آروماتیک ترکیبی یا مولکول حلقوی با چندین پیوند کووالانس هستند.

فلوروفورها گاهی به تنهایی به عنوان ردیاب در مایعات یا به عنوان رنگ برای رنگ آمیزی برخی ساختارها، به عنوان سوبسترای آنزیم ها یا به عنوان یک پروب یا نشانگر (وقتی فلورسانس آن تحت تأثیر جنبه های محیطی مانند قطب یا یون ها باشد) استفاده می شوند. به طور کلی آن ها به صورت کووالانسی به یک ماکرومولکول پیوند می خورند و به عنوان یک مارکر (رنگ، برچسب، گزارشگر) برای واکنش های آفینی یا زیست فعال (آنتی بادی، پپتیدها، اسیدهای نوکلئیک) عمل می کنند. از فلوروفورها به ویژه برای رنگ آمیزی بافت ها، سلول ها یا به عنوان موادی در روش های مختلف تحلیلی، یعنی تصویربرداری فلورسنت و طیف سنجی استفاده می شود.

با این حال در دهه 19 استفاده از فلوروکروم ها در تحقیقات بیولوژیکی برای رنگ آمیزی اجزای بافت، باکتری ها و سایر پاتوژن ها آغاز شد. تعدادی از این رنگ ها بسیار خاص بودند و باعث توسعه میکروسکوپ فلورسانس شدند.

سیستم میکروسکوپ فلورسانس دارای ویژگی هایی است، که آن را به یک ابزار ضروری در زیست شناسی و علوم زیست پزشکی و همچنین در علوم مواد، تبدیل کرده است. این ویژگی ها در میکروسکوپ نوری سنتی به راحتی در دسترس نیستند.

 استفاده از یک طیف از فلوروکروم ها امکان شناسایی سلول ها و اجزای سلولی را با دقت بالا در میان مواد غیر فلورسانس امکان پذیر کرده است. در واقع، میکروسکوپ فلورسانس قادر به نشان دادن حضور یک مولکول واحد است. از طریق استفاده از علامت گذاری فلورسانس چندگانه، کاوشگرهای مختلف می توانند به طور همزمان چندین مولکول هدف را به طور همزمان شناسایی کنند. اگر چه میکروسکوپ فلورسانس نمی تواند تصویر فضایی از نمونه های زیر حد رزولوشن میکروسکوپ ارائه دهد، ولی مولکول های فلورسانس در چنین محدودیت هایی به راحتی قابل تشخیص هستند.

برخی از نمونه ها وقتی مورد تابش قرار می گیرند، (بدون استفاده از فلوروکروم ها)  اتوفلورسانس داشته، در هنگام تابش نور منعکس می کنند. پدیده ای که به طور کامل در زمینه های گیاه شناسی، پترولوژی و صنعت نیمه هادی مورد بهره برداری قرار گرفته است. در مقابل، مطالعه بافت های حیوانی و پاتوژن ها اغلب با اتوفلورسانس مقدور نمی باشد. لذا از فلوروکروم (فلوروفور) ها استفاده شده که توسط طول موج های خاصی از نور تابش شده تحریک می شوند و نور را با شدت تعریف شده و مفید منتشر می کنند. فلوروکروم ها رنگ هایی هستند که خود را به ساختارهای مرئی یا نامرئی متصل کرده، اغلب در هدف گیری مورد و اتصال به آن بسیار خاص هستند و عملکرد قابل توجهی دارند. استفاده گسترده از میکروسکوپ فلورسانس ارتباط نزدیکی با توسعه فلوروفورهای مصنوعی و طبیعی دارد که با عوامل تحریک و انتشار، همراه با اهداف بیولوژیکی، به خوبی شناخته شده است.

 

• اصول تحریک و انتشار 

عملکرد اصلی میکروسکوپ فلورسانس تابش نمونه با یک باند با طول موج دلخواه و مشخص است و سپس فلورسانس منتشر شده بسیار ضعیف تر از نور اولیه منتشر می شود. در یک میکروسکوپ با پیکربندی مناسب، فقط نور تابشی باید به چشم یا آشکار ساز (دوربین، مانیتور) برسد، به طوری که ساختارهای فلورسنت حاصل با کنتراست بالا در پس زمینه بسیار تاریک (سیاه) روی هم قرار گیرند. عوامل تشخیص به طور کلی توسط پس زمینه تاریک اداره می شود و نور اولیه یا تحریکی معمولا چند صد هزار تا یک میلیون بار روشن تر از فلورسانس منتشر شده است.
 

شکل 1

شکل 1 مقطعی از یک میکروسکوپ اپی فلورسانس مدرن مجهز به تکنیک فلورسانس عبوری و انعکاسی است. روشن کننده عمودی در مرکز تصویر با منبع نور در یک طرف و مکعب فیلتر در طرف دیگر است. این طراحی همان میکروسکوپ نوری انعکاسی است که در آن طول موج نور منعکس شده طولانی تر از نور اولیه یا تحریکی است. یوهان S. Ploem با ساخت نورپرداز عمودی برای میکروسکوپ فلورسانس مجهز به نور انعکاسی شهرت دارد. در این نورپرداز، نور با طول موج خاص (باند طول موج مشخص)، اغلب در نواحی ماوراء بنفش، با عبور طیفی از نور از یک لامپ مخصوص الکتریکی یا منبع دیگر و عبور از فیلتر تحریک، یک نور با طول موج خاص تولید می‌شود.

طول موج های عبوری از فیلتر تحریک از سطح یک آینه دو رنگ یا پرتو رنگی، از طریق لنز شیئی میکروسکوپ برای پوشاندن نمونه با نور شدید، منعکس می شود. اگر نمونه فلورسانس شود، نور تابشی توسط عدسی شیئی متمرکز و از آینه عبور کرده، سپس توسط یک فیلتر طول موج‌های ناخواسته را مسدود می‌کند.

مهم است که توجه داشته باشید که فلورسانس تنها حالتی در میکروسکوپ نوری است که در آن نمونه، پس از تحریک، نور خود را تولید می کند. نور ساطع شده به صورت کروی در همه جهات، صرف نظر از جهت منبع نور تحریک، دوباره تابش می کند.

میکروسکوپ فلورسانس مدرن ترکیبی از قدرت اجزای نوری با کارایی بالا با ابزار کنترل کامپیوتری و کسب تصویر دیجیتال برای رسیدن به موقعیتی است که اجزاء بسیار ریز قابل مشاهده گردد. میکروسکوپ در حال حاضر به شدت به تصویربرداری الکترونیکی بستگی دارد تا به سرعت، اطلاعات را در سطوح کم نور یا در طول موج های بصری نامرئی به دست آورد. این پیشرفت های فنی اجزای ضروری میکروسکوپ نوری به عنوان یک سیستم هستند.

دورانی که میکروسکوپ نوری صرفاً یک ابزار مشاهده یا گاهی به عنوان یک اسباب بازی فکری بود، گذشته است. در حال حاضر، تشکیل تصویر نوری تنها اولین گام به سوی تجزیه و تحلیل داده ها است. تصاویر میکروسکوپی در ارتباط با آشکارسازهای الکترونیکی، پردازنده های تصویر، دستگاه های نمایش و سیستم های تصویربرداری، قابلیت های فزاینده ای پیدا می کند.

در این رابطه کنترل کامپیوتری فوکوس، کیفیت تصاویر، اجزای نوری، کرکره ها، فیلترها و آشکارسازها به طور گسترده ای مورد استفاده قرار می گیرد و دستکاری های تجربی را امکان پذیر می کند که با میکروسکوپ های مکانیکی امکان پذیر نیست. کاربرد فزاینده الکترو اپتیک در میکروسکوپ فلورسانس منجر به توسعه وضعیت نوری شده، قادر به شناسایی ساختارهای داخل سلولی یا ذرات، تصویربرداری از مولکول های انفرادی شده است.

منبع: Introduction to Fluorescence Microscopy | Nikon’s MicroscopyU